2021 年 8 月 9 日在线发布 。doi: 10.3389/fmicb.2021.705947
金黄色葡萄球菌_是全球奶牛乳腺炎的主要病原体之一。它是生乳的重要条件致病菌，肠毒素引起严重的食物中毒。监测原料奶中_金黄色葡萄球菌_的抗生素耐药性有助于_金黄色葡萄球菌_的风险评估。在本研究中，62 株（43.1%）金黄色葡萄球菌_从中国北疆四个地区的 144 个不同品种的零售原料奶样品中分离得到。其中，石河子、哈密、阿勒泰、塔城的隔离率分别为58.1%（54/93）、12.9%（4/31）、18.2%（2/11）、22.2%（2/9） . 牛奶样品中阳性菌株的分离率最高（61.7%，37/60），其次是骆驼奶（35.9%，23/64）和马奶（10.0%，2/20）。经典毒力基因检测结果表明，12.9%（8/62）的分离株携带至少一种毒力基因。主要基因型为_see (6.5%, 4/62)，其次是_sea + sec (3.2%, 2/62)、sea (1.6%, 1/62) 和_sec_（1.6%，1/62）。对62个分离株的13个耐药基因和对12种不同抗生素的敏感性分析表明，80.6%（50/62）的菌株至少对一种抗生素耐药，46.8%（29/62）对三种或更多抗生素耐药。抗生素。分离株对青霉素的耐药率最高（72.6%，45/62），25.8%（16/62）的菌株携带_blaZ_耐药基因。此外，32株（51.6%，32/62）耐甲氧西林_金黄色葡萄球菌_（被称为超级细菌）被检测到。所有分离株都具有形成生物膜的能力。脉冲场凝胶电泳结果显示，47个分离株显示出13个主要脉冲型（P1-P13）和26个亚型，相似度为80％，表明样品分布区域和来源的整体遗传多样性。这些发现表明，_金黄色葡萄球菌_对北疆地区的原料奶造成严重污染，对公众健康产生负面影响。因此，应采取控制措施和持续监测，以确保原料奶的质量和安全。
关键词：金黄色葡萄球菌，生乳，经典肠毒素，抗生素耐药性，生物膜，脉冲场凝胶电泳
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乳制品含有丰富的蛋白质、乳糖、乳脂和钙，是人体营养的良好来源。随着消费者对最低限度加工食品的兴趣日益浓厚，生奶的消费量也逐渐增加（EFSA 生物危害小组，2015 年）。然而，病原微生物已被引入乳制品的食物链（宋等，2015；乔勒等，2018），食源性感染在中国频繁发生（荣等，2017；陈和谢， 2019 年；吴等人，2019 年）。因此，饮用生奶可能对消费者的健康构成威胁（Claeys 等，2013）。
_金黄色葡萄球菌_是一种重要的人畜共患病原体，可引起人和动物的严重感染（Sergelidis and Angelidis, 2017 ; Papadopoulos et al., 2018）。一些国家约40.0%的乳腺炎病例是由_金黄色葡萄球菌_引起的（Kateete等，2013；Basanisi等，2017）。然而，_金黄色葡萄球菌感染后_可能会在奶牛的乳汁中排出，威胁消费者安全（Li et al., 2017）。因此，牛乳腺炎是一个全球性的挑战，因为它不仅会损害动物的健康，还会减少产奶量并增加医疗成本，最终导致乳制品行业的巨大经济损失（Botaro et al., 2015））。
_金黄色葡萄球菌_分布广、污染率高、传播速度快，致病力强。它会导致多种临床表现，从轻微局部，浅表皮肤损害严重的侵袭性疾病，甚至可能危及生命（Turner等，2019）。_金黄色葡萄球菌_感染的症状和严重程度与毒力因素有关（邢等，2016）。其中，葡萄球菌肠毒素（SEs）是导致食源性中毒的主要因素。食物中毒所致_金黄色葡萄球菌_携带的SE是在这两个发生，发展非常迅速，而且对人体健康造成极大的危害（Basanisi等人，2017年）。间的先前发现的超抗原葡萄球菌毒素，SEA，SEB，SEC，SED，SEE和是典型的肠毒素（Silva等人，2015）。由于它们的高稳定性，这些肠毒素在摄入后在消化道中保持活性（Fisher et al., 2018）。据报道，由这五种经典肠毒素引起的食物中毒占葡萄球菌食物中毒 (SFP) 病例的 95%，而其余 5% 的感染与新发现的 SE 有关 ( Korpysa-Dzirba and Osek, 2014 ; Papadopoulos et al ., 2019 年）。
抗生素治疗是控制牛乳腺炎和人类感染的重要措施( Gomes and Henriques, 2016 )。金黄色葡萄球菌_具有显着的抗生素耐药性和逃避人体免疫系统的能力（Liu et al., 2017）。越来越多的研究报道_金黄色葡萄球菌_产生耐药性，由单药耐药演变为多重耐药（MDR），使得解决抗生素耐药问题越来越难（Gomes and Henriques, 2016）。耐甲氧西林_金黄色葡萄球菌(MRSA) 代表获得_mecA 的__金黄色葡萄球菌_菌株编码青霉素结合蛋白 2a 的基因，介导对甲氧西林和所有其他 β-内酰胺类抗生素的耐药性，因此它代表了一个全球性的健康问题（Arsic 等，2012）。由于其严重性和流行性，MRSA引起的院内感染已被世界卫生组织列为世界三大传染病之一( Becker and Wardenburg, 2015 )。因此，监测原料奶中_金黄色葡萄球菌_的抗生素耐药性对于预测抗生素耐药性发展的速度和类型以及从食品安全角度进行动物抗生素治疗的决策非常重要（刘等，2017） .
生物膜形成可以增强细菌，包括毒力_金黄色葡萄球菌_，和被认为是重要的致病因子之一_葡萄球菌_（Lee等人，2014。 ; Bissong和Ateba，2020）。生物膜的产生不仅使细菌能够耐受恶劣的环境，而且降低了抗生素的渗透率，促进了抗生素耐药性决定因素的横向扩散，最终使这些细菌引起的感染的治疗复杂化（Savage et al.， 2013 年；马图尔等人，2018 年）。
_金黄色葡萄球菌_是全球公共卫生关注的主要病原体，在报道的食源性病原体中排名世界第三（Umaru等，2016）。由于原奶受到病原微生物的污染，特别是_金黄色葡萄球菌_产生的毒素，加上日益严重的耐药性问题，对原料奶中_金黄色葡萄球菌_的流行特征的研究引起了广泛关注。新疆是中国最重要的奶牛养殖区。它拥有 360 万头奶牛，平均年产奶量为 6,500 公斤/头（Dan 等，2019）。然而，在中国北疆的一些地区，原料奶的采集、加工和运输方式都采用传统方式，容易受到病原微生物的污染。因此，本研究着眼于新疆北部不同地区、不同来源的零售原料奶中_金黄色葡萄球菌_的流行情况及特征，以帮助相关部门制定原料奶及乳制品的安全风险管理措施，为相关部门制定安全风险管理措施提供科学的理论依据。从源头到餐桌，有效控制_金黄色葡萄球菌_在原料奶中的传播。
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本研究对北疆四个地区不同奶源的144份原料奶样品进行_金黄色葡萄球菌_分离结果显示，阳性菌株总分离率为43.1%，污染程度较高，与与Traversa 等人的结果。(2015)和艾哈迈德等人。(2019)。刘等人。(2017)确定从中国北方采集的 195 个原料奶样品中_金黄色葡萄球菌_的分离率为27.7%。赵等人。(2020)研究了山东省奶牛场的散装罐奶 (BTM) 样本，发现_金黄色葡萄球菌_污染率为 28.9%，略低于本研究。_金黄色葡萄球菌_污染了许多原料奶，这些原料通常与乳腺炎或人类携带者有关。不遵循良好的畜牧业和食品加工方法会导致成品受到污染（施密特等，2017）。综上所述，这种差异主要是由于牲畜养殖系统类型、动物种类、挤奶方式以及周围卫生条件的差异（Umaru et al., 2016））。因此，原料奶的采集、生产、运输和销售应规范化。同时，要对各个环节的操作人员进行相应的专业培训，尽量减少不良条件对原奶造成的污染，避免进一步危害消费者健康。
在这项研究中，12.9% (8/62) 的_金黄色葡萄球菌_菌株携带一个或多个毒力基因，并存在四种不同的基因型。其中，6.5%（4/62）的菌株具有_see_基因型，3.2%（2/62）的菌株具有_sea_ + sec_基因型。其余属于_海（1.6％，1/62）和_sec_基因型（1.6％，1/62）。在_海_和_秒_基因已在相关的研究，确定被检测到_的金黄色葡萄球菌_在原料乳，这与本研究的结果是一致的毒素基因（Cavicchioli等人，2015。 ; Xing等，2016。）。此处检测到的菌株均未携带_seb_或_sed_基因。Pexara 等。(2016)报告称，山羊奶中没有_金黄色葡萄球菌_分离株携带_seb_基因。奥拜达等人。(2018)也没有检测到_seb_基因，在 Jordan 的 BTM 中仅检测到0.6% 的_sed_基因。不同的研究报告了不同的毒力基因流行率，这可能与地理分布和样本来源有关（Zhao et al., 2020）。在这项研究中，所有带有 ELISA 检测到的毒力基因的分离株都至少产生一种肠毒素。其中，SEB 和 SEC 的生产频率较高，这与Carfora 等人的结果一致。(2015)和Pexara 等人。(2016)。因此，牛奶和乳制品是产生肠毒素的_金黄色葡萄球菌的_重要宿主。这一结果也揭示了对原料奶的潜在威胁，并表明有必要实施监测计划和预防措施。此外，应在社区开展畜牧养殖户和消费者的健康教育和宣传，提高对不良生产和饮食方式造成的SFP的预防和警惕。
抗生素治疗是控制乳腺炎的重要方法，但随着世界范围内抗生素耐药性的加速发展，抗生素治疗对_金黄色葡萄球菌的作用_正在恶化（Gomes and Henriques，2016）。因此，应监测抗生素的使用，以预测抗生素耐药性的发展速度和类型，也可用于从食品安全的角度对动物抗生素治疗做出决策，有助于评估_金黄色葡萄球菌_的风险。
肉汤微量稀释法对12种抗生素的敏感性试验表明，_金黄色葡萄球菌_对青霉素的耐药率最高（72.6%，45/62），25.8%（16/62）的菌株携带_blaZ_耐药基因。这种高频率与以往研究的结果一致（Jamali et al., 2014 ; Feng et al., 2016 ; Qu et al., 2019），主要是因为β-内酰胺在中国广泛用于治疗牛乳腺炎和土耳其（Aslantaş 和 Demir，2016 年）。此外，青霉素是人类医学中治疗_金黄色葡萄球菌的_首选（Thongratsakul 等，2020）。然而，据报道，一些国家的青霉素耐药性正在增加（Jahan et al., 2015 ; Aslantaş and Demir, 2016）。_金黄色葡萄球菌_的耐药性因地区而异，并受抗菌药物使用的影响（Ren 等，2020）。在我国，青霉素耐药率在宁夏为94.3%（王等，2016），陕西为80.5%（李等，2015），山东为74.4%（赵等，2020），31.3 % 在北京（Wang et al., 2018）。基于这些高耐药率，青霉素应谨慎用于_金黄色葡萄球菌_引起的乳腺炎。
本研究中，大多数菌株的基因型和表型在毒力或耐药性方面均未检测到显着相关性，这与一些研究相似。之所以会出现这种结果，可能是因为表型呈现由许多因素决定，例如点突变、生物膜形成和抗生素耐受性，而基因型仅由内部因素之一决定（Bissong 和 Ateba，2020）。
_金黄色葡萄球菌_普遍对多种抗生素耐药，属于耐多药，对乳品行业和食品公共安全影响较大（McDougall et al., 2014）。本研究中，50株（80.6%，50/62）_金黄色葡萄球菌_至少对一种抗生素耐药，与国内部分研究报道相近（Liu等，2017；Ren等，2020），但远高于一些国外，如意大利（39.4%）和波兰（28.3%）（Rola等，2016；Giacinti等，2017）。值得注意的是，本研究中 MDR 的比例较高（46.8%，29/62），因此_金黄色葡萄球菌_的致病性和传播风险不容忽视。表达MDR表型并具有产生生物膜和肠毒素能力的菌株的控制仍然是一个重要的公共卫生问题（Cavicchioli等，2015；Wang等，2016，2018）。
金黄色葡萄球菌_被认为是医院和社区获得性感染的主要原因（Gopal 和 Divya，2017）。本研究共发现32株（51.6%，32/62）MRSA菌株，与Al-Ashmawy等人的报道相近。(2016) (53.0%)，但高于Aqib 等人的报告。(2017) (34.0%)。此外，从石河子和阿勒泰采集的骆驼奶样品中分离出50.0%（16/32）的MRSA，从石河子和塔城的牛奶样品中分离出43.8%（14/32），其余6.3%（2 /32) 来自哈密的马奶样品。间的32 MRSA，20株MDR。与相关的许多食物中毒_金黄色葡萄球菌_是由MDR造成_金黄色葡萄球菌，包括 MRSA（Johler 等人，2015 年；Jans 等人，2017 年）。
由于细菌的进化和抗生素的滥用，_金黄色葡萄球菌_的耐药性逐渐增加。MRSA感染率在全球范围内呈上升趋势，MRSA已成为医院重要的细菌病原体（Song等，2016；Tenhagen等，2018）。的_金黄色葡萄球菌_抗性机制是复杂的，尤其是MRSA的。因此，它是重要的指导意义理解的耐药性_的金黄色葡萄球菌_在时间和研究的耐药性特征和机制_的金黄色葡萄球菌_在畜牧业中使用抗生素。
微量滴定板是量化生物膜形成能力最常用的技术之一（Angelopoulou 等，2020）。许多比较表型生物膜产生敏感性的研究表明，微量滴定板检测比刚果红琼脂更灵敏、更特异、更准确（Torlak 等人，2017 年；Triveni 等人，2018 年）。本研究发现所有分离株均具有形成生物膜的能力，这与Wang等人的研究一致。(2018)。Bissong 和 Ateba (2020)还报告说，90.9% (70/77) 的分离株是生物膜生产者。此外，我们发现大多数分离株（66.1%，41/62）是强生物膜形成菌株。然而，研究哈苏奈等人。(2020)表明，57 株_金黄色葡萄球菌_中强、中、弱生物膜形成菌株的比例分别为 12.3、80.7 和 7.0%。特里维尼等人。(2018)报道，在 188 株_金黄色葡萄球菌_中，只有 72 株 (38.3%)被筛选为生物膜生产者，其中 34 株 (18.1%) 是强生物膜形成株，38 株 (20.2%) 是中等生物膜形成株. 生物膜表型分类的差异可能是由于对结果的解释不同造成的。因此，标准化生物膜形成的方法和解释至关重要。同时，_金黄色葡萄球菌_来自不同来源（人类或动物）和地理来源的生物膜也可能具有不同的形成能力。充分解释这些不同的来源非常重要（Bissong 和 Ateba，2020 年）。
挤奶设备清洁不当会导致牛奶残留。这些有机残留物在挤奶过程中为细菌的生长提供了营养，并增加了微生物粘附在表面以及随后形成生物膜的风险（Alonso和Kabuki，2019；Latorre等，2020）。的能力_的金黄色葡萄球菌_生物膜粘附到的材料，如橡胶和器具的不锈钢表面，及设备在奶牛场或在乳品加工环境中，已被证明（Lee等人，2014）。其中，icaA、icaD、bap_等基因在_金黄色葡萄球菌_生物膜形成中起重要作用。_. 这些基因的存在可能代表了一种重要的粘附于生物或非生物表面的机制，例如挤奶设备表面（Castelani et al., 2015 ; Ren et al., 2020）。因此，需要进一步研究以确定参与生物膜形成的已知基因的存在，并将其应用于奶牛场设备和器具生物膜形成的研究。
许多不同的分子分型方法已被用于比较_金黄色葡萄球菌_的风险，包括多基因座可变数量串联重复分析、葡萄球菌蛋白 A 分型和 PFGE（Roussel 等，2015）。PFGE 是一种高度鉴别技术，用于表征不同细菌病原体的遗传多样性，包括_金黄色葡萄球菌_( Tang, 2009 )。它不仅成本低，而且不需要详细的生物信息或软件。PFGE 仍然是对合作位置葡萄球菌进行分类的黄金标准（Sarah et al., 2017）。在这项研究中，根据 PFGE 分析，在 47 个分离株之间获得了 13 个脉冲型（P1-P13）和 26 个亚型，具有 80% 的相似性。其中，P3 型在观察到的所有脉搏类型中具有最丰富的多样性。图1，包括8个亚型（P3-i-P3-viii）和14个分离株，这些分离株来自两个地区的两种奶源（石河子牛奶和阿尔泰骆驼奶），表明该脉冲型在不同地区流行。新疆北部。夏尔马等人。(2017)报道了一些菌株在牛奶运输过程中从一个地区传播到另一个地区，这与本研究的结论相似。PFGE结果表明分离株在区域分布和样品来源方面具有遗传多样性。